多能干细胞(PSC)培养体系应在正常情况下准备传代时收获并冷冻保存。每支冻存管应包含6孔板中一个孔收获的细胞。如果使用其他培养皿，请相应地调整体积。

单细胞冻存

注意：打开之前用70%的乙醇或异丙醇擦拭瓶身。

以下说明适用于在mTeSR1 / mTeSR Plus / TeSR™-E8™/ eTeSR™#100-1215 /中培养的6孔板细胞的冻存，如果使用其他的培养皿，请相应的调整体积。细胞应该在可传代时进行收获和冻存。

1. 使用前将培养基（DMEM/F­12或hPSC培养基），解离试剂和无Ca++和Mg++的D­PBS恢复到室温。

注意：不要在37°C水浴中加热培养基。

2.用1 mL的无Ca++和Mg++的D­PBS润洗需要传代的培养孔。

3. 吸去润洗液，加入适当的解离试剂，37°C孵育适当时间。

注意：在mTeSR1 / mTeSR Plus / TeSR™-E8™中团块培养的细胞可使用GCDR(Gentle Cell Dissociation Reagent#100-0485 )进行解离，每孔添加1ml，孵育8-10min。在eTeSR 中单细胞培养的细胞可使用TrypLE™ Express Enzyme#Thermo Fisher 12605028 或者 ACCUTASE™#07920 进行解离，每孔添加0.5ml，孵育4-8min。

4. 用1 mL的移液器枪头或者移液管收集细胞，反复吹打数次确保获得单细胞悬液，并将细胞转移到15 mL的锥形试管中。用另外的2-4mL的培养基 （DMEM/F­12或hPSC培养基）润洗培养孔，把润洗后的培养基也加入到细胞收集管中。

5. 用台盼兰染色进行活细胞计数。

6. 在室温（15-25°C）下，以300 x g离心5分钟。

7. 小心的用吸管去掉上清液，留下少量的培养基，确保细胞聚集体完好。轻弹管壁重悬细胞团。

8. 加入预冷的（2-8°C）FreSR™­S ，调整密度到1 x 10^6细胞/mL，并彻底混匀。

9. 每个冻存管加入1 mL的单细胞悬液。

注：eTeSR 中培养的细胞可选择每支冻存管加入0.5ml的单细胞悬液。

10. 冻存细胞:

· 推荐使用缓速降温方法，每分钟降低1度，随后可以在-­135°C液氮或更低的温度长期保存。不推荐在-80°C长期保存。

· 逐步降温法：-­20°C保存2个小时，然后-­80°C中保存2个小时，随后可以在-135°C液氮中或更低的温度长期保存。

单细胞复苏

应将hPSC细胞解冻到包被好的培养皿中。通常，如上所述冷冻保存的每支冻存管1×10^6个细胞可以成功复苏到6孔板的1-2个孔中。

1.在开始方案之前，准备好所有试管、温热的培养基(15-25°C)和含15 mM HEPES的DMEM/F-12以及包被好的培养皿，以确保尽快完成复苏程序。

注意:不要在37°C水浴中加热培养基。

2.将Y-27632添加到培养基中，使最终浓度达到10µM。

注意：eTeSR培养基应该按照正常培养时所需的完全培养基来配制，同样需要补充10µM 的Y-27632 /10%的CloneR™2#100-0691。

3.用70%乙醇或异丙醇擦拭细胞瓶的外部。

4.在生物安全柜中，将盖子旋转四分之一圈以释放内部压力，然后重新拧紧。

5.轻轻摇动小瓶，在37°C水浴中快速解冻细胞。当有小的冷冻细胞沉淀残留时，取出小瓶。不要涡旋振荡细胞。

6.用70%的乙醇或异丙醇擦拭冻存管的外部。

7.使用1 mL移液器将冻存管中的内容物缓慢转移到一个15 mL锥形管中。提前在管中加入5-7mL的DMEM/F-12。

8.在室温(15-25°C)下以300 x g离心细胞5分钟。

9.用移液管小心移去上清液，留下少量上清以确保细胞沉淀不受干扰。

10.向试管中加入1 mL含有10 M Y-27632的培养基。轻轻吹吸。

11.将细胞接种到包被好的培养皿上。

注意:一般来说，一支含有1 x 10^6个细胞的冻存管可以复苏并接种到6孔板的1 - 2个孔中。

12.将培养皿放入37℃的培养箱中。前后左右轻柔晃动培养皿，使细胞均匀分布在孔中。24h内不能扰动培养皿。

13.根据需要更换培养基，并每天目测评估细胞，以监测生长情况，直至下一次传代时间(即80 - 90%融合)。复苏后大约需要2 - 5天。

注：mTeSR Plus/ eTeSR培养基可以每天或每隔一天更换。若连续两天跳过换液，需要添加两倍体积的培养基。

注意:当使用不同的细胞系时，达到80 - 90%融合的时间可能不同；应在显微镜下监测培养物，直到确定最佳传代时间。

注：eTeSR 进行单细胞培养，可能在达到70%-95%的融合时进行传代。

14.使用标准技术进行传代培养。